熒光壽命測量頻域法和時(shí)域法的原理

熒光壽命測量原理

熒光壽命是衡量一個(gè)熒光基團激發(fā)態(tài)通過(guò)發(fā)射光子回到基態(tài)的時(shí)間。熒光壽命的范圍可以從皮秒到幾百納秒。下面列出一些常見(jiàn)物質(zhì)的的熒光強度和熒光壽命。

一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，當其返回基態(tài)，光子數衰減到原來(lái)的1/e，或36.8%，所經(jīng)歷的時(shí)間即為熒光壽命：

如熒光強度衰減圖（圖1）所示，熒光壽命t是熒光強度衰減到原來(lái)1/e的時(shí)間。熒光強度與衰減時(shí)間的函數：

I（t）是指時(shí)間為t時(shí)的熒光強度，α是一個(gè)標準系數，τ是時(shí)間壽命。

了解熒光壽命的基本理論對于理解利用熒光壽命進(jìn)行定量分析的方法是非常重要的。

目前測定熒光強度的方法主要有“時(shí)域法”和“頻域法”兩種。

時(shí)域法

所謂時(shí)域法，就是一定發(fā)射強度的短脈沖光照射樣品，并記錄時(shí)間。短脈沖光以前使用的是閃光燈，分辨率可以達到幾個(gè)納秒?，F在用的是激光光源，分辨率可以達到皮秒或更短。

圖1。表示的短脈沖光激發(fā)下的熒光熒光的衰減圖。

如果用場(chǎng)波長(cháng)的激發(fā)光激發(fā)，熒光強度和壽命是一個(gè)單指數關(guān)系，這時(shí)壽命可以也可以用曲線(xiàn)的斜率直接測定。如果壽命時(shí)間和激發(fā)脈沖光的分辨率比較接近，計算時(shí)間壽命必須去除“堆積”效應。

我們正努力數學(xué)的方法研究“反堆積”對激發(fā)脈沖光的影響?？梢钥吹降臒晒馑p的曲線(xiàn)形狀（見(jiàn)許多章節[ 2 ]）。目前，隨著(zhù)告訴脈沖激光的出現，這些“反堆積”過(guò)程對于大多數壽命測量已經(jīng)變得不那么重要了，盡管它們仍然存在。測量時(shí)，可以使用與壽命時(shí)間相當的光脈沖。

頻域法

頻域法的原理是：

E(t)and E0分別是時(shí)間在t和0的熒光強度，ME是調制系數，
是光束的調制頻率，圖二顯示的是熒光強度和熒光壽命時(shí)間的關(guān)系。

圖2 藍色是激發(fā)光譜，紅色是熒光光譜，可以顯示它相對于激發(fā)光譜的相位偏移

熒光多相位解頻的公式如下：

相位移：

這兩種關(guān)系都與衰變時(shí)間τ有關(guān)，用儀器測量解調系數和相位，在不同的調制頻率偏移（通常為15-20），數據對理論模型進(jìn)行擬合。因此利用相移和相對調制可以確定全程相位τP和全程調制τM.，如果熒光衰減是單指數，然后τP和τM將取決于調制頻率。

τP和τM和的差異主要是頻率形式，即分析方法基礎上的差異，包括壽命和振幅。

必須注意區分總強度f從到α的影響度，即之前說(shuō)的時(shí)間域。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)之間的關(guān)系是由：

其中J代表所有成分的總和，α指前因子，τ是這些物質(zhì)的壽命。

分析

多頻相位和調制數據通常用非線(xiàn)性小二乘法進(jìn)行分析，其中實(shí)際相位和調制率數據（不是壽命值）適合于單個(gè)或多個(gè)指數衰減的不同模型。

擬合的質(zhì)量是通過(guò)減少的卡方值判斷

除了使用離散指數衰減模型進(jìn)行衰減分析外，還可以選擇將數據擬合到分布模型。在這種情況下，假定發(fā)射態(tài)的激發(fā)態(tài)衰減特性實(shí)際上導致了大量壽命分量。下面是一個(gè)典型的壽命分布圖。單色氨酸含蛋白-人血清白蛋白。

圖三所示為頻率響應曲線(xiàn)（相位和調制率VS 調制頻率）。人血清蛋白HAS在激發(fā)光源LED300nm，下，使用長(cháng)通320nm濾片在20℃收集發(fā)射信號。使用洛倫茲變換擬合數據（中心點(diǎn)5.4ns，寬度2.9ns，分布98%）和另一個(gè)離散擬合數據部分（t=0.51ns，分布0.02%）。這里顯示的分布是Lorentzian，而是取決于系統的衰減動(dòng)力學(xué)，不同類(lèi)型的分布，如高斯，或不對稱(chēng)分布（普朗克），可以利用。本文描述了壽命分析的方法。

應用

熒光壽命的測定

熒光壽命是表征熒光物質(zhì)和熒光性質(zhì)的重要手段。蛋白質(zhì)的生物物理研究，例如特定的氨基酸殘基之間的距離由福斯特共振能量轉移（FRET）。此參數主要不受內部過(guò)濾效果，靜態(tài)淬火和熒光基團的濃度變化的影響。因此有利于臨床和高通量篩選（HTS）應用于鑒別生物樣品高背景熒光的應用。

另外，這個(gè)參數在多路復用方面提供了更多的優(yōu)勢。區分兩個(gè)熒光基團的能力，具有相似的光譜但不同的壽命是另一種增加測量參數的方法，例如[ 5 ]?？梢岳脦追N機制來(lái)開(kāi)發(fā)基于壽命的分析方法。有簡(jiǎn)單的結合分析，在結合2部分組成（一個(gè)被熒光標記）是伴隨著(zhù)參數的變化。另一種情況是猝滅釋放型分析，淬滅的物質(zhì)有低但有限的熒光，但初存在大量過(guò)剩。如果熒光化合物被釋放（與互補的DNA鏈結合）（分子信標）或酶促反應）系統的壽命增加。熒光共振能量轉移分析中能量傳遞效率的測量方法，為避免供體和受體之間的光譜重疊問(wèn)題，可以采用非熒光受體。

熒光壽命的測量

目前使用的大多數熒光傳感器和檢測都是基于強度測量的。雖然這些方法更容易實(shí)現，但是需要頻繁校準[ 6 ]。許多基于強度的測量相關(guān)的難點(diǎn)，是可以規避使用壽命為基礎的基于壽命的測量，具有與熒光無(wú)關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。在過(guò)去的10年中，許多研究顯示了分析物敏感的熒光壽命的變化。鑒定和特征。其中一些探針列于表2中。關(guān)于基于生命周期的詳細討論監測我們參考你在[ 6 ]章節的“終身監測”章節。

熒光壽命成像

在熒光顯微鏡下測量探針濃度，也為熒光壽命也提供了新的機會(huì )。熒光圖像的對比度是建立在每一對探針的熒光壽命的創(chuàng )建圖像點(diǎn)。典型的例子是細胞參數的映射，如pH值、離子濃度或氧。熒光猝滅，熒光共振能量轉移，光子誘導能飽和轉移（寵物）。生命成像技術(shù)的生物學(xué)應用的例子包括組織表面的掃描，光動(dòng)力療法，DNA芯片分析，體貌成像和其他（見(jiàn)例[ 7 ]）。